SILAC-美吉生物

美吉生物

蛋白质组学和代谢组学 定量蛋白质组学 SILAC

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            SILACstable-isotope labelling by amino acids in cell culture)技术,指利用含轻、中或重型同位素标记的必需氨基酸(主要是Lys和Arg)培养基培养多组细胞,标记细胞内新合成的蛋白质,一般培养5-6代,细胞中的蛋白质将都被同位素标记。比如A组和B组,A组是在包含正常氨基酸(light)的培养基中;B组的培养基则含有“重型(heavy)”的氨基酸,即稳定同位素标记的氨基酸。细胞5-6代后,稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到蛋白中,取代了原有的氨基酸,这样,两个蛋白之间就存在分子量的改变,而其它化学性质无异。然后将两组细胞混合,提取出蛋白质,质谱进行测定。通过比较质谱图中肽段信号峰的峰面积大小进行相对定量研究。该技术适用于细胞和动物的体内标记,具有系统误差小,定量准确,并且可以进一步寻找具有时效性变化的差异蛋白,更精准地研究刺激的作用机理等技术特点。

    细胞实验流程


    动物实验流程




    技术平台

    Triple TOF 5600, Q-Exactive, Orbitrap Fusion™ Tribrid™

    技术优势

           高通量:可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质;

        定量精确:降低由于样品制备不同而造成的实验差异;

      线性定量范围广;   

      灵敏度更高:蛋白质需要量明显减少;

      重要的的体内标记技术,更接近样品真实状态,适用于培养细胞或者小鼠蛋白质表达动态变化研究。

    应用领域

    机理和调控机制研究 

    动态过程中机制研究

    疾病标志物的筛选  

    用药及预后标志物筛选




    生信分析


     送样要求

    样品类型

    样品要求(/组样品)

    备注

    蛋白质溶液

    蛋白质总量≥300µg

    重复实验则量翻倍,建议准备两份样品备用。

    组织样品

    样品总量≥0.1g

    按照蛋白质组织提取效率(蛋白:组=7%

    细胞样品

    细胞数量≥107

    胰酶消化,按细胞冻存标准离心收集细胞即可。

    体液样品

    清≥200µL,脑脊液≥200µL,尿液≥1mL ,泪液≥1mL。

     


    案例:细胞信号通路中T细胞精氨酸甲基化的变化差异

              本文研究精氨酸甲基化在免疫调节中的作用,通过异甲硫氨酸甲酯的SILAC培养基培养人T细胞进行实验,共鉴定到了1257个看家蛋白质的2502个精氨酸甲基化位点,发现精氨酸甲基化转移酶在T细胞活化和分化过程中起到了关键作用。




    参考文献:

           Geoghegan, V., et al. (2015) Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature communications 6, 6758.




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